Vitamin B đóng vai trò quan trọng trong sự vận động, tăng trưởng và phát triển bình thường của con người. Ngày nay, trên thị trường có nhiều sản phẩm giúp bổ sung vitamin như các thực phẩm công thức sữa, bột dinh dưỡng... Trong đó, sữa công thức là thức ăn bổ sung quan trọng cho trẻ nhỏ. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình chiết xuất vitamin nhóm B trong mẫu sữa bột công thức. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các vitamin nhóm B (B2, B3, B6, B9) trong nền mẫu sữa bột công thức được tối ưu hóa quy trình chiết xuất và định lượng bằng phương pháp HPLC/PDA. Kết quả: Quy trình chiết tối ưu dùng 4mL dung môi trichloroacetic acid (TCA) ở nồng độ 3%, chiết siêu âm trong 25 phút và tủa protein lặp lại 2 lần. Kết luận: Phương pháp chiết xuất đơn giản, hiệu quả, lặp lại và độ thu hồi cao, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm nhằm phục vụ cho nghiên cứu định lượng các vitamin nhóm B (B2, B3, B6, B9).Vitamin B plays an important role in human growth and development. Nowadays, many products help supplement vitamins such as milk formula foods, and nutritional powders on the market. Among them, formula milk powder is an important supplementary food for young children. Objective: Optimization of extraction B vitamins from formula milk powder samples. Materials and methods: B vitamins (B2, B3, B6, B9) in the formula milk powder sample were optimized for extraction and quantification using the HPLC/PDA method. Results: The optimal extraction process used 4mL of trichloroacetic acid (TCA) solvent at a concentration of 3%, ultrasonic extraction for 25 minutes, and protein precipitation repeated twice. Conclusion: The extraction method is simple, effective, repeatable and high recovery, suitable for laboratory scale to serve quantitative research on B vitamins (B2, B3, B6, B9).