Cordyceps militaris (C. militaris) has been utilized as an herbal medicine with diverse therapeutic properties in Asian countries. It can be a prominent resource of secondary metabolites that possesses remarkable biological activities. Herein, this study investigated the phytochemical screening, antimicrobial, antioxidant, and cytotoxic activities of the fruiting bodies of C. militaris using ethanol solvent. Qualitative phytochemical screening of the ethanol extract revealed the presence of proteins, carbohydrates, phenolics, tannins, flavonoids, and saponins, especially cordycepin and adenosine. The agar well diffusion method demonstrated that the ethanol extract exhibited sensitive activity against Staphylococcus aureus (ZOI = 30.33 ± 2.08 mm) and moderate activities against at for Salmonella spp. (ZOI = 16.33 ± 1.52 mm), Escherichia coli (ZOI = 9.33 ± 1.15 mm) as well as Aspergillus niger (ZOI = 7.83 ± 0.76 mm) at 100 mg/mL concentration. The 2,2-diphenyl[1]1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging activity with the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 217.85 ± 33.16 µg/mL was conducted for the extract at 500 µg/mL. The protective effect against oxidative damage to DNA induced by hydrogen peroxide and UV radiation was observed with the treatment. Moreover, the results assessed C. militaris extract inhibited the growth of the MDA-MB-231 cell line compared to control. At the same time, these treatments affected the increase of the cell proliferation of normal human fibroblast cell line at 134.85 ± 35.18%. The data in this work indicated that C. militaris extract had significant biological properties and could be applied to herbal supplements and medicines in the pharmaceutical industry.Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được dùng như thảo dược truyền thống tại nhiều quốc gia Châu Á và cung cấp các hợp chất sinh học quan trọng. Nghiên cứu này đánh giá định tính và định lượng các hợp chất sinh học, hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng oxy hóa và độc tính từ cao chiết ethanol của quả thể nấm dược liệu được nuôi trồng này. Các nhóm hợp chất xuất hiện bao gồm protein, đường, phenolic, tannins, flavonoid, saponin, cordycepin và adenosine. Hoạt tính kháng vi sinh vật được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn trên các vi khuẩn bao gồm Staphylococcus aureus (30,33 ± 2,08 mm), Salmonella spp. (16,33 ± 1,52 mm), Escherichia coli (9,33 ± 1,15 mm) và nấm Aspergillus niger (7,83 ± 0,76 mm). Hoạt tính kháng oxy hóa bằng khả năng bắt gốc tự do DPPH có phần trăm ức chế IC50 là 217,85 ± 33,16 µg/mL và có khả năng bảo vệ sự phân mãnh DNA. Cao chiết có khả năng gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB-231 không đáng kể nhưng kích thích tăng sinh tế bào bình thường ở người là 134,85 ± 35,18 % tại 100 µg/mL. Như vậy, cao chiết có chứa các hợp chất sinh học có giá trị và có tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm chức năng và phát triển thuốc.