The use of dietary supplements containing lactoferrin is a growing trend. As a result, there is a need for a simple and reliable analytical method to determine the content of lactoferrin in these supplements to ensure food quality. In this study, an HPLC method was developed and validated for determining lactoferrin in dietary supplements using a HiTrap Heparin clean-up column in combination with HPLC. The study involved selecting optimal conditions for extracting lactoferrin from the sample matrix, followed by chromatography conditions using a C4 column (150 mm × 4.6 mm, 3.5 µm). The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were determined, with the achieved values being 1.2 mg/100g and 4.0 mg/100g, respectively. The method has shown good recovery (99.5–103.4%) and precision (RSD 1.76–3.44%), meeting the method performance requirements outlined in AOAC SMPR 2020.005. The validated method was applied to determine the contents of lactoferrin in dietary supplement samples.Thực phẩm bổ sung chứa lactoferrin đang có xu hướng ngày càng tăng. Do đó, một phương pháp phân tích đơn giản, đáng tin cậy để xác định lactoferrin đã được xây dựng, giúp kiểm soát chất lượng thực phẩm. Trong nghiên cứu này, phương pháp xác định lactoferrin trong thực phẩm bổ sung sử dụng cột làm sạch HiTrap Heparin kết hợp với HPLC đã được phát triển và thẩm định. Nghiên cứu đã lựa chọn các điều kiện tối ưu để chiết lactoferrin ra khỏi nền mẫu, sau đó tách sắc ký trên cột C4 (150 mm × 4,6 mm, 3,5 μm). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng được tiến hành trên mẫu thực có hàm lượng thấp, giá trị LOD và LOQ đạt được lần lượt là 1,2 mg/100g và 4,0 mg/100g. Phương pháp có độ thu hồi (99,5– 03,4%) và độ chụm tốt (RSD 1,76–3,44 %) đáp ứng yêu cầu về hiệu năng phương pháp theo AOAC SMPR 2020.005. Phương pháp sau khi thẩm định đã được áp dụng để xác định lactoferrin trong mẫu thực phẩm bổ sung.