Trong nghiên cứu này, qui trình phân tích sử dụng thiết bị sắc kí lỏng siêu hiệu năng khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) được phát triển và áp dụng nhằm xác định hàm lượng Auramine O trong thức ăn chăn nuôi. Mẫu được chiết bằng hỗn hợp dung dịch MeOHH2O (91) + HCOOH 0,1%, và định lượng trên UPLC/MS/MS. Pha động sử dụng nước siêu tinh khiết với 0,1% axit formic. Ở điều kiện tối ưu, khoảng tuyến tính của Auramine O từ 20 đến 100μg/L và hệ số tương quan tuyến tính đạt trên 0,99. Giới hạn định lượng Auramine O là 0,34mg/kg. Trong khoảng nồng độ nghiên cứu (20 - 100μg/L), tỉ lệ thu hồi của Auramine O trong khoảng 64,71 - 94,12% với độ lệch chuẩn (RSD) là 4,93 - 8,31%. Phương pháp đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, qui trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh, phù hợp trong phân tích hàm lượng Auramine O trong thức ăn chăn nuôi và các mẫu thực phẩm khác.