Thuốc lá (Nicotiana tabacum) là một trong những cây công nghiệp quan trọng ở Việt Nam. Hiện nay, công tác tuyển chọn, lai tạo giống thuốc lá ở nước ta chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái và các tiêu chí chất lượng. Việc phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử đã mang lại nhiều thành công trong chọn tạo giống thuốc lá trên thế giới, tuy nhiên các nghiên cứu ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp 16 đặc điểm hình thái và 5 chỉ thị phân tử SSR để đánh giá sự đa dạng của 71 nguồn gen thuốc lá Việt Nam. Kết quả đánh giá dựa trên đặc điểm hình thái cho thấy các dòng thuốc lá được phân chia thành 3 nhóm với sự khác biệt về các đặc điểm hình thái quan trọng như tổng số lá, chiều dài, rộng của lá, khối lượng lá khô và tươi. Ở kết quả đánh giá đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị SSR, 71 nguồn gen thuốc lá nghiên cứu có tính đa dạng cao với chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) và giá trị khác biệt di truyền (Uhe) đều lớn hơn 0,5. Đáng chú ý, kết quả phân nhóm thông qua chỉ thị phân tử SSR có mức độ tương đồng cao với cách chia nhóm dựa trên đặc điểm hình thái, đặc biệt là chỉ tiêu năng suất. Điều này cho thấy tiềm năng phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử SSR trong hỗ trợ công tác chọn tạo giống thuốc lá ở Việt Nam trong tương lai.